蜂胶抗氧化活性的测定方法

发布时间:2011-08-15 15:05    文章来源:湖北天马养蜂场    浏览量:3038 次    【字体大小:正常 偏大 最大

摘要:蜂胶对机体的诸多保健功效与其抗氧化活性有着密切的关系。本文对目前国内外采用的清除羟自由基和氧自由基能力测定法、β-胡萝卜素-亚油酸法、清除DPPH自由基法、ABTS阳离子脱色法、FRAP法、ORAC法等抗氧化活性测定方法的原理及优缺点作了概述和分析。

关键词:蜂胶;抗氧化活性;自由基;测定方法

国内外大量的科学研究证明,蜂胶对机体的诸多保健功效与其抗氧化活性有着密切的关系。因此,蜂胶的抗氧化活性特别受到研究者的关注和重视。本文对目前国内外采用的各种抗氧化活性测定方法的原理及优缺点作了概述和分析。

1清除羟自由基能力测定法

对羟自由基清除能力的测定采用Fenton试剂(过氧化氢和硫酸亚铁),原理是以过氧化氢为氧化剂以Fe2+为催化体系,所产生的经自由基与结晶紫作用后使体系吸光度降低,利用吸光度值的变化间接测定所产生的羟自由基。

2清除氧自由墓能力测定法

清除氧自由基能力的测定主要利用某些体系如在氧化过程中有超氧阴离子自由基(O2-)的生成,O2-与某些化合物作用,产生有特定吸收波长的有色物质,利用分光光度计测定。蜂胶若能清除O2-,则吸光度发生变化,就能间接判断蜂胶对超氧阴离子自由基(O2-)的清除作用。邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化,自氧化过程中产生O2-,O2-又加速邻苯三酚自氧化速率,同时产生有色中间物质。有色中间产物的积累在滞后30~45s与时间呈线性关系,一般维持4min左右,随后减慢。有色中间产物在325nm处有强烈的光吸收。由于自氧化的速率依赖于O2-的浓度,消除O2-则抑制自氧化反应,阻止中间产物的积累,从而评价蜂胶清除O2-的能力。

蜂胶抗氧化活性的测定方法

3β-胡萝卜素-亚油酸法

β-胡萝卜素变色是广泛使用的抗氧化分析方法主要评价的是蜂胶在乳化脂质体系中的抗氧化能力,因为β-胡萝L素对由自由基介导的氧化反应极度的敏感。β-胡萝卜素分子结构中有11个共扼双键,是一种多烯色素,在470nm处有吸收峰,它易被氧化而褪去颜色。亚油酸酯的自氧化速度是油酸酪的10~40倍,更容易形成自由基。在反应介质溶液中,由亚油酸氧化产生的过氧化物能使β-胡萝L素褪色,随时间的延长,吸光度值越来越小。β-胡萝L素退色的程度与体系中物质的抗氧化活性的强弱有关,抗氧化能力越强,吸光度值下降越慢。在评价蜂胶的抗氧化活性中,胡萝L素变色法也是常用的方法。

4清除DPPH自由基法

评价蜂胶的抗氧化活性常采用清除DPPH自由基方法。DPPH自由基(二苯代苦味肼基自由基)是一种稳定的以氮为中心的质子自由基,其乙醇溶液呈紫色,在517nm处有强烈吸收。在有自由基清除剂存在时,自由基清除剂提供一个电子与DPPH的孤对电子配对,而使其褪色,褪色程度与其接受的电子呈定量关系,在517nm处的吸光度变小,其变化程度与自由基清除程度呈线形关系,即自由基清除剂的清除自由基能力越强,吸光度越小。DPPH自由基已被广泛用于测试各种样品的自由基清除活性。利用清除DPPH自由基方法评价抗氧化活性方法简单,因而被广泛用于抗氧化活性筛选。但DPPH方法存在的不足是,DPPH既是氧化剂又是自由基指示剂,当被测物与DPPH紫外吸收有交叠时,会影响测定结果。此外,DPPH的颜色虽然主要因单电子转移反应消除,但也可以由氢转移反应消除。由于空间位阻决定反应的倾向,因此小分子化合物由于更接近自由基而拥有相对较高的抗氧化能力。许多在体内与过氧自由基发生快速反应的抗氧化剂可能因空间位阻等原因不易与DPPH自由基反应。同时,该方法的线性范围也相对较窄。

5ABTS阳离子脱色法

ABTS[2,2-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)]阳离子脱色试验是一种广泛用于评估各种物质抗氧化活性的分光光度分析法。ABTS阳离子自由基的产生是通过ABTS原液与过硫酸钾在室温黑暗中反应12~16h而完成的。在供氢抗氧化剂出现的情况下,ABTS阳离子自由基将会减少。与其它几种总抗氧化能力体外测定法相比,ABTS法快速、简便,与抗氧化剂的生物活性相关性强。但ABTS法本质上是一种间接方法,是用来检测物质清除ABTS。这种自由基的能力,与真实的氧化分解没有关系,它只是用TEAC值来表征测试样品与经氧化得到的ABTS反应的能力而非阻断该氧化过程,TEAC值在概念上类似于阻断系数,并不是直接反应被检物质的活力,所以要想较全面的判断一种物质的抗氧化能力还要结合其它的方法。

6FRAP法

铁还原抗氧化能力测试(FRAP法)评价蜂胶的抗氧化性原理为:Fe3++-三吡啶三吖嗪(TFTZ)可被蜂胶样品中还原性物质还原为二价铁形式,呈现出明显的蓝色,并于593nm处具有最大光吸收,根据吸光度的大小计算蜂胶抗氧化活性的强弱。FRAP反应属于单电子转移反应,测定样品离子还原能力与大多数抗氧化剂介导的自由基熄灭反应有很大不同。因此,FRAP方法不能测定那些通过熄灭自由基(氢转移反应)起作用的物质,尤其是琉基和蛋白。该方法的另一缺陷是很多物质发生氧化还原反应的时间比较长,所以选择不同的反应时间终点对结果影响很大。

7ORAC法

氧化自由基吸收能力测定法(0RAC法)是目前抗氧化研究领域中备受关注的一种新的评价方法。该方法以偶氮类化合物AAPH作为过氧自由基来源,SodiumFluorescein为荧光指示剂,维生素E水溶性类似物Trolox为定量标准,使用荧光微孔板分析仪进行分析,可用来测定样品清除ROO·、·OH等自由基的能力。该方法的专属性、线性、精密度、准确度及重复性等与其它抗氧化能力分析方法相比具有诸多显著的优点,但是该法的自动化程序需要昂贵的全自动生化分析仪,而手工操作程序费时费力,所以较难在国内一般实验室推广应用。

8结语

蜂胶抗氧化能力测定的根本标准和目的就是最高限度地、客观地反映蜂胶的抗氧化活性,在蜂胶的抗氧化活性研究中有三个要素:一是以什么作为基质体系来测定;二是以什么方式来加速;三是用什么来指示反应终点。这三要素中的任何一个要素的改变都会使测定结果发生变化。要针对不同用途和目的,选择相适应的测定方法。

FRAP、ABTS和DPPH三种方法消除自由基的机制与ORAC方法不同,属于单电子转移(ET)机制,其测定过程中不包含活性氧,而是测定蜂胶对高价态离子的还原能力。此外,这些方法并不能完全反映抗氧化剂阻断或打破自由基链式反应的抗氧化能力。但包括ORAC方法在内的许多抗氧化能力测定方法的结果有时不具有一致性。这主要是来自于抗氧化物质、自由基以及二者之间的作用机制的复杂性。因而没有任何一种单一反应可以精确地反映所有的自由基或混合物中所有的抗氧化剂的抗氧化能力。因此,目前通常采用三种以上的氧化体系来全面综合评价蜂胶的抗氧化活性。更多养蜂技术和蜂产品知识请关注湖北天马养蜂场官方微信公众号:"honeymarket",或者加QQ号2969169050,欢迎投稿和交流讨论蜜蜂文化。

参考文献(略)

《中国蜂业》2009,59(5)

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