摘要本文比较系统地阐明蜜蜂遗传标记的定义和研究范畴。蜜蜂遗传标记包括外部形态、解剖学形态、细胞学、生化和分子遗传标记，其中可作为生化标记的同工酶有苹果酸脱氢酶(MalateDehydrogerase，MDH)、乙醇脱氢酶(AlcohalDehydrogenase，ADH)、酯酶(Esterase，EST)、苹果酸酶(MalioEnzyme，ME)、肽酶(PEP)和蛋白质－3(P－3)等。分子遗传标记主要包括限制性酶切长度多态性(RFLP)、随机引物扩增多态性DNA(RAPD)、微卫星DNA和线粒体DNA(mtDNA)标记，对这些分子遗传标记在蜜蜂研究中的应用情况作了概述。
关键词：蜜蜂；遗传标记；形态标记；细胞学标记；生化标记；分子标记
蜜蜂遗传学实验通常将可识别的等位基因称为蜜蜂遗传标记，用来研究基因遗传和变异规律。等位基因是在染色体上占据同一座位的基因的不同形式，也是在蜜蜂群体中遗传多态性的表现形式。遗传标记经常用在两类遗传学实验中，第一类是遗传学研究中最基本的工作，即连锁分析、基因定位和遗传作图，第二类是研究基因的转移。将遗传标记作为其所在染色体、染色体区段、座位及外源DNA片段的标记。在传统的杂交育种过程中常将标记基因作为供体亲本的染色体及其片段掺入的判断依据，而在细胞融合及基因工程研究中，遗传标记的应用已成为选择和筛选的主要手段。
随着生物学各个分支学科的发展，蜜蜂遗传标记从外观形态的表现型，扩展到生理、生化、细胞等多个方面。但是，所有这些不同类型的标记都是以生物学的性状形成进行判别，即在检测时几乎离不开蜜蜂的活体形式。如蜜蜂的抗病基因是以人工饲养的蜂群的抗病力强弱为标记的，抗瞒基因是以蜂群是否被蜂螨寄生、寄生率高低等为标记的。直到20世纪60年代，同工酶标记的兴起，遗传标记的识别才突破活体的形式，所谓同工酶标记是指编码功能相同、结构和组成略有不同的一类酶的等位基因。同工酶的不同形式可以通过电泳或色谱的方法予以区分，并用专门的染色反应予以显示。从检测方法的角度看，同工酶标记是一类新型的遗传标记，但仍没有突破表达基因的范围。
美国的Botstein等(1980)首先提出DNA限制性片段长度多态性(RFLP)可以作为遗传标记，从此开创直接应用DNA阶多态性发展遗传标记的新阶段。20世纪80年代后期，DNA聚合酶链式反应(PCR)的发展，也使直接扩增DNA的多态性成为可能，在此基础上又产生了各种新型的分子标记，如随机扩增多态性DNA(RAPD)、微卫星标记等。各种分子标记的应用，使遗传学进入了一个日新月异的发展阶段。这里所指的分子标记是以DNA多态性为基础的标记。目前在蜜蜂中应用较多的分子标记主要有RFLP、RAPD、微卫星标记和线粒体DNA。
一、形态标记
形态标记就是一种特定的肉眼可见的外部特征，而且影响这一特征的基因及其所在的染色体、基因与相邻基因在染色体上的相对位置已得到明确阐明，可以用其标记某一染色体区段，并对其他未定位的基因进行连锁分析。形态标记在一些农作物如水稻、玉米中已有大量报道，而蜜蜂形态标记的研究还处在对蜜蜂形态特征的直观认识水平，即形态特征的描述，对影响这些特征的基因及其所在的染色体上的位置尚未得到明确阐明。如果在蜜蜂的形态标记方面取得突破，确定诸如控制体色的基因在第几条染色体上的位置，这无疑地在蜜蜂遗传学上具有重要意义。
⒈外部形态标记蜂种外部形态特征是人类对某蜂种最直观、最简单的认识和描述，感官直接或通过较简单的实验手段就能达到检测蜂种的目的，也是蜜蜂分类学家最常用的方法，研究历史悠久。形态性状基因的染色体定位最初是通过性状间的关联和经典的二点、三点测验进行的，通过判断不同性状间的遗传是否偏离依照独立分配所预期比例来确定控制这些性状的基因是否位于同一染色体上，以性状间的重组率的大小作为这些基因在染色体上的相对距离，并确定其毗邻关系。在蜜蜂的形态特征中，现已发现有三对基因是连锁的，眼睛的黄绿色(ch)和无毛(h)基因，交换值为4．1％：眼睛的珍珠色(pe)和奶油色(cr)基因，交换值为0．33％；眼睛的石榴红(g)与小翅(di)基因，交换值为14．5％。
⒉解剖学形态标记从广义上讲，形态特征还包括解剖学形态、生理特性等。咽下腺(又称王浆腺)是位于工蜂头腔内的一对呈葡萄状的腺体，其表面结构、解剖发育规律、泌浆机理、显微测量及活性分析等领域已有研究。王浆腺分泌王浆能力的大小，称为王浆腺的活性。Hassanein(1952)指出以王浆腺小囊大小代表王浆腺活性：Pickard(1966)等提出以王浆腺的重量来表示王浆腺的活性；Bruwers(1982)首次把短期体外放射化学来测定王浆腺体外合成蛋白质的速率，并以此作为王浆腺活性的指标；曾志将(1991)提出以咽下腺小囊数目表示王浆腺的活性；林雪珍等(1994)发现在意蜂不同品种之间咽下腺小囊数目存在显著差异，咽下腺小囊数目可作为意蜂品种鉴定的一个指标。苏松坤等2002年测定了11个西方蜜蜂蜂群的王浆产量与工蜂头重、体重、头体重比、咽下腺小囊个数、咽下腺长度的相关性，发现咽下腺长度与王浆产量的相关性最高，咽下腺长度可作为王浆产量较理想的形态标记。
二、细胞学标记
摩尔根将孟德尔所称的“遗传因子”的行为与细胞核染色体的行动结合起来研究，将这些“因子”与染色体上呈直线排列而染色明显的念珠状颗粒物对应起来，从而将“遗传因子”——基因落实到染色体上占有一定位置的实体，这导致细胞遗传学的诞生。染色体结构变异体和非整倍体等细胞学标记材料，常常具有特定的形态学特征，使其很容易与对应的二倍体区别开来。非整体的蜜蜂往往不能存活，所以蜜蜂细胞学标记的研究较困难，目前仅研究到蜜蜂染色体组型、相对长度、臂比、G-带和C-带分析水平。
三、生化(同工酶)标记
1941年美国遗传学家和生化学家通过研究红色面包霉的生化突变型，对一系列营养缺陷型的遗传分析提出了“一个基因一个酶”的假设，创立了生化遗传学。50年代许多科学家发现同一种酶可具有多种不同的形式，同时由于淀粉凝胶技术的发展和组织化学染色剂的使用，使这样的多种形式成为肉眼可辨的带型——酶谱。蜜蜂同工酶的研究表明，同工酶等位基因变异性低，到目前为止已知蜜蜂中的多态性位点有6种。研究较多的是各种蜜蜂的同工酶基因型、基因型频率、基因频率、杂合度等，为蜜蜂分类提供更为准确的依据。同工酶及蛋白质多态性是生化变异的主要组成部分，它们可作为分类的依据和遗传标记，在蜜蜂遗传育种研究中已得到应用。
⒈苹果酸脱氢酶(MDH)从20世纪70年代开始，许多学者经过多次实验，确定了蜜蜂Mdh由a，b，c三个等位基因控制，这三个等位基因在不同的地理种群中分布不同，有的种群有三个等位基因，有的种群有两个等位基因，有的种群只存在一个等位基因，没有多态现象。Nunamaker和Wilson(1981)从南非的两个地方，取了19群非洲蜜蜂做为试验材料，发现都是aa型纯合子；Badino等(1982，1983)报道，在广大意大利的山麓地区意大利蜂表现出一个纯合的cc等位基因的频率分布，来自法国的一个蜂场的欧洲黑蜂表现为等位基因b的单态性。众多的研究结果表明布，意大利蜜蜂(A.m.ligustica)中等位基因c占有优势；欧洲黑蜂(A.m.mellifera)中b的含量最高；而非洲蜜蜂(A.m.scutellata)和非洲化蜜蜂中a的含量最高。Robinson(1988)利用苹果酸脱氢酶同工酶作为遗传标记，发观采集蜂、守卫蜂、清理死尸的工蜂的苹果酸脱氢酶同工酶基因型不同，从而得出基因型决定成年工蜂劳动分工的结论。该理论在西方蜜蜂中已得到不断的证实并渐趋公认。关迎探等(1994)对意蜂的三个血统——“浙农大1号”意蜂、湖北本意和原意的MDHⅡ进行测定，发现它们的基因型频率、基因频率之间存在显著差异，为“浙农大1号”意蜂品种的确立提供一个生化和遗传依据。
⒉乙醇脱氢酶(ADH)Martin(1977)在雄蜂和工蜂蛹中发现有3个Adh等位基因的多态性酶系。该等位基因频率在非洲化蜜蜂和欧洲蜜蜂中是不同的。在小幼虫中并没有发现有ADH的活性，在预蛹期和白眼蛹时活性达到最大，在羽化的蜜蜂中活性下降直至全部消失。
⒊酯酶(EST)西方蜜蜂的酯酶至少有一种是多态性的，具有三种表型。从酶谱分析编码此酯酶的基因座位有两个不同的等位基因。据李绍文等(1985)报道，中蜂没有此酯酶，而在意蜂中此酯酶在蛹期有明显的变化，白眼蛹(1～3天)没有这种酯酶，红眼蛹(6～7天)这种酶表现较浅的颜色，褐眼蛹(10～12天)时这种酶呈现深色带。
⒋苹果酸酶(ME)Sheppard和Berlocher(1984)发现挪威的6群欧洲黑蜂的苹果酸酶具多态性。1985年，他们又在意大利的5群意蜂中检测出此酶的多态性。但李绍文(1985)对北京意蜂进行酶谱分析时，未发现有多态现象。
⒌肽酶(PEP)DelLhama和Mestrsner(1984)报道了PEP的多态性和一个空白的等位基因。
⒍蛋白质-3(P-3)Mestriner(1969)测定了由2个不完全显性的等位基因决定的多态性的P—3的遗传，它们只出现在蛹期。
四、分子标记
⒈RFLP标记1980年Botstein首先提出用RFLP作为标记构建遗传连锁图谱的设想，并在1987年由Donis—Keller等建成了第一张人的RFLP图谱。所谓RFLP，是指用限制性内切酶酶切不同个体基因组DNA后，含同源序列的酶切片段在长度上的差异。差异的显示和检测是用克隆的DNA片段作为同源序列探针进行分子杂交，再通过放射自显影(或非同位素技术)实现。
由于非洲蜜蜂和欧洲蜜蜂在外部形态上非常相似，因此，只有借助分子遗传标记才能将两者区分开来。Muralidharna和Hall(1990)报道利用3个从蜜蜂DNA克隆出的探针鉴别非洲蜜蜂和欧洲蜜蜂的限制片段长度多态性(RFLP)，在检测出的14个等位基因中，其中5个等位基因只出现在非洲蜜蜂中，2个等位基因只出现在欧洲蜜蜂中，而其余的等位基因在非洲蜜蜂和欧洲蜜蜂中出现的频率不同。Oldroyd(1994)报道利用从西方蜜蜂基因文库中制备一个探针检测小蜜蜂(Apisflorea)的采蜜(水)蜂、采粉蜂、守卫蜂、煽风蜂的DNA产生的“指纹”，这些“指纹”在不同分工的工蜂中是不同的，有力地证实了遗传因素决定成年蜂分工的理论。Sheppard(1991)利用RFLP作为遗传标记研究南美洲的欧洲蜜蜂被非洲化蜜蜂渐渗的情况。Blanchelot(1991)报道利用特殊的寡核苷酸重复序列作探针，进行RFLP分析，产生DNA指纹，用来估测蜂群中不同个体间的亲缘关系。
McMichael(1996)利用限制性片段长度多态性DNA的高度多态性位点区别西方蜜蜂的欧洲亚种和非洲亚种。
⒉RAPD标记在PCR技术的基础上，williams等(1990)采用随机核昔酸序列为引物扩增基因组DNA的随机片段，获得了一种新的分子标记，即随机扩增多态性DNA(RandomAmplilledPlymorphismicDNA)，简称RAPD。所谓的RAPD标记实际上是用随机序列组成的寡核昔酸通过专门的PCR反应扩增获得的长度不同的多态性DNA片段。Fondrk(1993)利用RAPD标记分析蜂群中个体之间的亲缘关系。美国科学家Hunt等利用RAPD标记构建西方蜜蜂(ApismelIifera)遗传连锁图，并确定了控制蜜蜂采粉行为、螫刺行为、体长大小、报警信息素水平的数量性状基因位置。
⒊微卫星DNA标记微卫星DNA又称为短串联重复(ShonTandemRepeat)，简称STR，它们的多态性又称为简单序列长度多态性(SimpleSequenceLengthPolymorphism)，简称SSLP。这是一类由几个核苷酸(一般为1—5个)为重复单位组成的长达十几个核昔酸的串联重复序列。同一类的微卫星DNA可分布于整个基因组的不同位置上。例如，在人类基因组中广泛存在的一种微卫星DNA是(dC－dA)n(dG－dT)n，由于重复的次数不同以及重复程序的不完全而造成了每个座位的多态性(Weber，1990b)，这种多态性的信息量是比较丰富的。
法国科学家Estoup(1993)报道在西方蜜蜂中也有十分丰富的微卫星标记。Estoup等先后利用微卫星标记分析蜂群内个体间的亲缘关系，估计与蜂王交配的雄蜂的个数，确定了西方蜜蜂由三个亲缘较远的血统进化而来。Arnold(1996)利用2个多态性微卫星位点对一个蜂群的工蜂进行分析，能够有效地区别蜂群内不同亚家系的工蜂。BeyeM．(1998)利用微卫星技术可以方便地检测蜂群的父系血统。Franck(1998)利用微卫星技术研究西方蜜蜂欧洲亚种的起源。Franck(1999)利用微卫星技术研究蜂王交尾后不同时间其受精囊内精于的混合程度。Neumann(1999)利用4个多态性微卫星位点研究不同类型交尾场的蜂王交配的次数。Franck(2000)利用8个多态性微卫星位点检测近东地区蜜蜂的DNA，证实近东地区蜜蜂是西方蜜蜂的第四个血统。Neumann(2000)利用4个多态性微卫星检测错投对考察场蜂群蜂蜜产量的影响，发现错投对蜂蜜产量的影响不显著。
⒋线粒体DNA(mtDNA)线粒体是细胞中进行能量代谢的细胞器。1963—1964年，M．Nass和S．Nass在电镜下观察到了mtDNA，并通过核酸酶处理证实了线粒体内存在DNA。进一步研究发现，线粒体具有自我繁殖所需的组分，包括DNA、DNA聚合酶、核糖体、tRNA、RNA聚合酶、氨基酸活化酶等，是一种半自主性的细胞器。线粒体DNA是蜜蜂唯一的核外遗传物质。线粒体DNA可因碱基的插入和缺失而增加或减少限制性酶切位点，采用RFLPs、PCR-RFLP、等位基因特异扩增法(ASA)或长距离PCR法对mtDNA进行分析，可获得丰富的多态性信息。蜜蜂线粒体DNA遗传多样性是一种重要的遗传资源，可利用该分子遗传标记对蜂种进行分类鉴定、鉴别不同蜂种之间的差异、研究蜜蜂群体遗传结构等。mtDNA对于鉴别不同的蜜蜂亚种很有用，如果证实了某一限制图谱或某一mtDNA限制片段的长度为某一亚种的特征，那么可以将它作为该亚种的遗传标记而与其他亚种区别开来。
五、各类遗传标记的特点湖北天马养蜂场，加我们的微信一起学养蜂。
大多数形态标记具有典型的形态特征，比较容易识别和观测，因而便于确定它们与其他性状的关系。同时，由于试验设备简单，分析成本低廉，使它们不仅成为大多数物种连锁群建立的开创性标记，而且在其他分子标记的定位中也起着重要作用。但其缺点是有些形态标记与其他有害或不利性状相连锁具有不良的多效性，使分析和利用受到限制。此外，利用形态标记进行数量基因定位还需要严格控制试验环境，以使不同个体间形态特征的差异更为明显。细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的缺点，但这种标记材料的产生需要花费大量的人力进行培育和选择，由于蜜蜂忍受染色体结构和数目变异能力较差而难以获得相应的标记材料。与经典的形态标记和细胞学标记相比，从微生物到高等真核生物DNA分子多态性是普遍存在的，它是自发产生的，在同一基因座位上有较多的等位基因，因而在应用范围上所受限制较少，这对于形态标记和细胞学标记发展不够充分的蜜蜂尤为重要：分子多态性对蜜蜂本身通常无害，对重要经济性状很少有次级效应，因而具有很大的选择余地；分子多态性通常能在个体、组织、器官和细胞水平测定，且不受环境影响，遗传分析可以在蜜蜂发育的各个时期进行，这给研究工作提供了极大的方便3分子多态性基因座位的等位基因为共显性，在分离群体中能区别所有可能的基因型，或至少是显性(而不是隐性)的，因而可以在所有杂交组合中使用。分子标记所具有的这些优点给基因定位尤其是数量性状的基因定位展示了美好的前景。但分子标记特别是RFLP分析过程复杂，分析和检测需要特定的仪器设备，单个样本的分析成本较高。
中国养蜂2004（2）