摘要近年来，分子生物学的迅速发展和广泛应用，使得熊蜂属系统进化研究方法发生重大的变化，系统进化的分子生物学研究方法正慢慢地向传统系统进化方法渗入。与传统的表型特征相比较，分子生物学方法受到环境的影响较少，因而更能反映出生物体在演变进化过程中的本质，其研究结果也更可靠。本文就目前国内外熊蜂属系统进化领域的分子生物学研究方法进行了综述，主要包括染色体计数法、蛋白质分析法、DNA测序法。
关键词熊蜂属，系统进化，染色体计数，DNA测序，分子分类
1引言
熊蜂为膜翅目(Hymenoptera)蜜蜂总科(Apoideo)熊蜂族(Bombini)熊蜂属(Bombus)种类的总称，熊蜂属分成35～43个亚属，主要熊蜂亚属(BombusLatreille/‘true’bumblebee)和拟熊蜂亚属(Psithyms)。熊蜂亚属(‘true’bumblebee)大约有250种，原始社会性群居，级型分化程度明显，有三型蜂即蜂王、工蜂、雄蜂；拟熊蜂亚属(Psithyrus)约44种，寄生性繁殖，没有工蜂级型，拟熊蜂的雌性蜂侵占熊蜂的蜂巢，利用寄主熊蜂繁育其后代。目前，有关拟熊蜂亚属隶属于熊蜂属还存在一定争议。熊蜂是一种形态相对多变的社会性昆虫，运用形态特征方法进行系统进化的研究已有很多报道，但存在如形态特征信息含量不足、趋同进化的干扰、表型性状受外界环境因素影响等不足，给传统的系统进化研究带来了困难。随着分子生物技术的发展，利用分子生物学方法对熊蜂系统进化的研究已取得了一定进展，本文就目前国内外熊蜂系统进化的分子生物学研究方法作了综述。
2熊蜂系统进化的分子生物学研究方法
随着20世纪80年代中期PCR技术的产生、发展及其在昆虫中的应用，利用分子生物技术和手段研究昆虫遗传进化和系统发育，从生命的本质上探索昆虫的系统发育关系成为昆虫系统学研究中的一个新热点。与表型特征相比较，应用分子生物学方法较少受到环境的影响，因而更能反映出生物体在演变进化过程中的本质，其研究结论也更可靠。目前，许多科研工作者已用分子生物学方法进行熊蜂系统进化的研究，其研究的主要方法有染色体计数法、蛋白质电泳分析法、DNA测序分析法、微卫星标记法。
2.1染色体计数法
低渗处理可以使染色体展开，从而可以进行精确地染色体计数和详细地研究染色体形态，通过研究熊蜂染色体数、着丝点、二级结构的特征，可以对其进行分类，从而对生物种的系统进化进行研究。1954年Whelden等用切片的方法对B.fervidus熊蜂染色体进行研究，得到其染色体数有12条，但1970年Cruzier等证明这种方法不适合于膜翅目。1972年Ken和Silveira等研究报道B.atratus和B.morio熊蜂的单倍体染色体数都是20条。1983年Owen等对15种北美熊蜂的染色体进行计数得到熊蜂亚属Bombuss.str和Pyrobombus单倍体染色体数都是18条，而亚属Separatobombus和Cullumanobombus有19条单倍体染色体。Psythyrusashtoni种有25条的单倍体染色体，是Bombus属中单倍体染色体数最高的，也是蜜蜂总科中单倍染色体数最高的，这为Psithyrus是单系群起源提供有利证据。Owen根据其所测4个亚属14种熊蜂(BombusLatreille)和1个拟熊蜂种(Psithyrus)的染色体数得出结论，在Bombus属中，单倍体数目在亚属内是恒定的，而亚属间其数目有变化，可以根据染色体的数目进行亚属的鉴定，而且其简约性比较好。综上所述，我们可以看出利用染色体数目和形态对亚属进行系统进化的研究是可行的，但由于目前对熊蜂染色体的研究比较少，可获得的数据有限，应用染色体数进行系统进化的研究还存在一定的困难，而且有关其准确性还有待于进一步的验证。
2.2蛋白质分析法
从系统进化角度看，真核生物体内蛋白质的结构和功能存在着高度的稳定性；不同的生物体中其蛋白质存在一定的差异，可以通过聚丙烯酰氨凝胶电泳的方法把不同的蛋白质分离开，用染料对其进行染色显影从而得到不同的蛋白质电泳图谱，根据电泳图谱进行系统进化分析。目前，已有50多种酶用于研究不同的生物种群变异，其中同工酶和异型酶电泳技术是昆虫分子系统学常用的方法。早在1973年Stephen和Cheldelin就研究了21种BombusLatreille亚属的熊蜂和4种Psithyrus亚属熊蜂胸部肌肉的α-磷酸甘油脱氢酶同功酶(GDH)得到一个拟熊蜂的酶分布谱图；三个Bombus亚属种酶分布谱图。在GDH分布谱图中，拟熊蜂4个种的GDH同功酶谱一样，而且不同级型和年龄的熊蜂酶谱都相同，酶都由4个非等位基因控制。1970年Fink等用醋酸纤维素作为介质分离熊蜂的GDH得到6种同功酶，它们把得到的酶谱条带分成“快的”和“慢的”迁移组，这结果与StePhen和Cheldelin所观察到的3个迁移组不一致，但是他们得出相同的结论，即大部分的胸部GDH活性在GDH“慢的”迁移组，单倍体雄性蜂在GDH含量上没什么区别。
1979年Pekkarinen研究发现在B.pascuorum、B.mniorum、B.pallidofacies、B.sparreanus种中，酶的变异力和地理差异没有相关性，即使是在颜色多态性的B．lucorum雄蜂中也没有相关性，颜色深浅和酶变异力也没有相关性，在相对于其它种来说颜色变化比较大的B.pascuorum种，其酶变异力也是很低。熊蜂种的等位基因变异力也比较低，在亲缘关系近的亚属Bombus中只有1～2个主要基因变异，Bombus种的等位基因差异性很小，但Pyrobombus具有更多杂合等位基因。酶表型图分析结果表明：由形态把熊蜂分成两部分Anodontohombus和Odontobombus不是遗传本质上的区别，熊蜂亚属Bombus和Bombias代表两个明显GDH稳定的分支属，拟熊蜂是单系群起源于Bombus群。PekkaPamilo等利用10种酶的凝胶电泳迁移率对熊蜂属6个亚属26种熊蜂进行聚类分析，其结果把这6个亚属的系统进化关系归成4组，而且也显示出了一个比较好的亚属水平聚类分析，特别是拟熊蜂亚属的归类地位有了很好的界定，但Pyrobombus亚属的部分种类与Melanobombus和Alpigenobombus亚属有重叠现象。Melanobombus与Pyrobombus的亲源关系比较近，与其它亚属的亲源关系比较远。从Pekkarinen等的研究结果可以看出其分类结果除了Melanobombus亚属的分群与1985年Ito分群结果不一样外，其余的都与Ito根据生殖器分类的结果一致。1990年Scholl等研究了10个BombusS．Str种，根据其酶的研究数据B.moderatus与欧洲的B.hyPocricta和B.crytarum种，还有亚洲种B.hypocrita亲缘关系近，而与B.lucorum，B.occidentalis，B.terricola种的亲缘关系远。1992年Scholl等用21种同功酶研究BombusLatreille亚属，证实B.frankliniFrisont与B.occidentalis是不同种。
1995年Scholl等应用同功酶电泳的方法研究熊蜂B.nevadensist和B.aurcomus亚种的变异，发现这些种在遗传上是有差异的。酶的电泳数据表明当前被列为亚种的B.nevadensis和B.auricomus两种熊蜂是不同种，和以前调查者根据颜色分类的结果是一致的，身上的绒毛颜色变异可能是同域群Mullerian拟态趋同进化的结果。据以上前人的研究结果我们可以看出利用不同酶和蛋白质的电泳可以把熊蜂属不同的种和亚种分开，这为我们进行系统进化的分子水平研究奠定了基础，但由于蛋白质电泳实验大部分需要新鲜的样本，大多数的熊蜂标本都是采集后经酒精浸泡过，体内的酶和蛋白质已降解，而且当品种多时进行蛋白分比较困难故此方法进行熊蜂属系统进化研究还存在一定极限性。
2.3DNA测序法
目前，在昆虫分子进化和分子系统学领域中。应用核酸序列分析技术测定昆虫特定核昔酸序列，推断不同昆虫类群之间的演化关系是昆虫系统进化的研究方向。DNA测序法是通过特定的引物对不同种特定的核苷酸序列进行扩增，对所扩增产物进行测序，应用相应的分析软件进行序列分析，从而得出不同种的系统进化关系。早在1996年Pedersen就测定了5种熊蜂和6种拟熊蜂532bP细胞色素氧化酶I基因(COI)的部分序列，用简约性和最大可能性系统进化分析表明B．lucorum作为独立一支序与拟熊蜂及其它真熊蜂成为姊妹群，拟熊蜂属是一个单系群，其隶属于熊蜂届，这一结果与利用形态特征和酶电泳数据结果是一致的。1998年Kater5na等通过对线粒体细胞色素b基因(Cytb)测序发现13个地区B．pascuorum熊蜂种存在遗传变异，阿尔卑斯山的北部和南部地区存在不同，然而在这两地区的熊蜂在很大的范围内具有相似性，B.pascuorum种有6个不同的单模标本。
1999年StellaKouliano通过比较线粒体Cytb、CO1的序列对Pyrobombus、Bombus、Melanobombus3个亚属12种熊蜂的系统发育关系进行研究，结果表明Pymbombus、Melanohombus亚属的名字不能精确的反应出其系统发育关系，建议把现存的分类系统改成单系群的种群或把所有的亚属名字都忽略，Pyrobombus亚属和Melanobombus亚属的亲缘关系近已由形态测定和分子研究确定了。Weerathep利用线粒体COⅡ部分的核苷酸序列和tRNAleu与COⅡ基因间的间隔序列二级结构分析太平洋西北Bombus亚属的系统发育关系，而且与欧洲的种类进行了对比。Weerathep也用线粒体COⅡ整个序列对太平洋西北的熊蜂进行系统发育的分析。2002年Pederson等基于分子系统发育树认为AlPiaobombus与Bombuss.Str是姊妹群，两个基本的熊蜂亚属Mendacibombus和Bombias分别发生在古北区和新北区。
邵志勇等通过比较一段357bp的细胞色素b的序列，研究了熊蜂属5亚属11种熊蜂系统发育关系。根据P-距离构建的邻接树(NJtree)和最大简约树(MPtree)都显示同样的结果：Mendacibombus(av．inovielllus)分化最早；Fervidobombus(Pensylvanicus)次之；Pymbombus(impatiens)和Bombus形成姊妹群；Bombus亚属是单系群。其中B．ignilus在所研究的5个种中分化最早。2003年Kawakita等应用三个核苷酸序列建立了一个比较全面的熊蜂系统进化关系树，其研究表明Fewidobombus亚属的多样性从旧世界到新世界的南部，有一个系统进化的组成；Fervidobombus传播到热带雨林，和两个热带雨林种B.transversalis和B.Pullatus，还有另外一个种B.atratus组成一分支，它们广泛地分布在南美和低洼地的亚热带生境中。2004年Kawakita等研究结果表明Mendacibombus，Bombias，Kdlobombus亚属的基本位置和其以前研究的结果保持一致。综上所述，我们能够看出：90年代以来，大部分的研究者都是利用DNA测序的方法研究熊蜂的系统进化，DNA序列分析可以检测出比较序列中单碱基的变化，是研究生物遗传变异最灵敏的方法之一，利用DNA序列分析法已对拟熊蜂和熊蜂的系统进化位置有了一个好的界定；但由于目前各研究者的采样地点和分析的方法不同，其所建的系统进化关系树都存在一定局限性。
综合以上各种方法，我们可以看出研究方法不一样所获得的信息和结果存在差异。而各种方法所得到的数据都有其不足之处，因此依靠单个方法得出的结论还存在一定争议。因此，我们进行系统进化研究时必须综合各种方法，还有结合传统形态学方法，才能更好地解决熊蜂系统进化关系问题。
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利用分子生物学方法可以从本质上揭示了生物的系统进化关系；建立生物系统进化树，使人类对生物系统进化关系的认识更具客观性。目前，应用分子生物技术对熊蜂系统进化研究已取得一定成就，克服了形态学分类缺点，如近缘种、复合体、姐妹种等鉴别上的困难。分子生物学方法不仅可以弥补形态学在种下分类上的不足，也可用来区别近缘种、隐种、长期饲养于实验室种群的品质，比较其与野外自然种群的差别；但由于采样的地点不同、分析方法不同，应用分子生物学技术进行系统进化研究还存在一定局限性。
引自《中国养蜂》2005（8）