蜂花粉的多酚和黄酮类成分

发布时间:2011-09-10 17:03    文章来源:湖北天马养蜂场    浏览量:3104 次    【字体大小:正常 偏大 最大

多酚类和黄酮类物质广泛存在于植物类食品并被认为是有效的抗氧化剂。抗氧化作用的最新研究聚焦于酚类物质,例如黄酮类物质。黄酮类物质主要由花色素、黄酮醇、黄酮、儿茶酚和黄烷酮组成。这些物质对减少器质性病变,诸如癌症、动脉硬化的发病率起到了重要作用。食源黄酮诸如槲皮素、芦丁和芹菜配基(5,7,4-三羟基黄酮)能够抑制致癌剂引起的大鼠和小鼠的肿瘤。这些化合物作为有效的抗氧化剂能够促进机体的快速生长,已经引起了广泛关注。另一方面,含大量能产生R00-的油质的食物能促进由N-亚硝基-N-甲脲引起的大鼠结肠癌的发生,这都显示ROO-潜在的致癌和促癌作用。而富含自由基清除剂(多酚和黄酮类物质)的饮食可以减轻R00-的促癌作用。

花粉的黄酮多以糖苷的形式存在,即一个糖的半缩醛经基与苷键和苷元结合,非糖部分叫糖苷配基或配糖体,在葡糖苦酶的作用下生成,D-葡萄糖是最常见的结合糖,D-半乳糖和L-鼠李糖也常见。有时在黄酮上连接二糖和三糖(芦丁),在不同植物中发现游离黄酮苷元的报道逐年增加。但是,很少有人关注它们是否真的以游离态存在,更少的人去关注它们是存在外部结构还是内部结构。蜜蜂采集的花粉团中混合有蜂蜜和蜜蜂唾液腺的分泌物,该分泌物中存在α和β葡萄糖苷水解酶。因此,蜂花粉中的黄酮主要以游离态黄酮苷元存在,干燥蜂花粉中游离芦丁的聚集显然是由于葡糖苷酶的作用。研究表明黄酮可以作用于新陈代谢和生长发育,有人关注它的被动保护作用,授粉中它作为一种花的吸引剂。

由于大多数黄酮糖首标准品无法购买到,逐个定量检测黄酮糖苷是非常困难的,将糖苷水解成苷元为黄酮的定量检测提供了有效方法。这种方法在蜂花粉中并不需要,因为蜜蜂咽下腺分泌物将黄酮糖苷水解为游离黄酮苷元,增加了生物活性。

通过测定蜂花粉的其他成分如游离氨基酸,确定蜂花粉及其加工产品的新鲜程度。市场销售的花粉一般采用人工加热干燥。在蜂花粉已鉴定的众多化合物中,研究较多的是蛋白质、游离氨基酸;脂肪、脂肪酸和固醇、膳食纤维、维生素、糖、矿物元素和微生物。欧洲市场销售的蜂花粉品质以游离氨基酸最低含量为2g/100g作为推荐标准,与游离氨基酸成分相比,黄酮组分在鉴定蜂花粉的品质方面是一个更好的指标。

一、花粉形态分析

花粉形态分析与国际生物学联合会(IUBS)的国际蜜源植物协会(ICBB)要求一致,采用Louveaux的方法,10g花粉与50mL水混合15min,在分析花粉前取10mL液体用30mL水进一步稀释,按照Vergeron的方法用显微镜对花粉粒计数。

二、物化分析

1、总酚和鞣酸

总酚和鞣酸的含量用Marigo法(有部分修正)进行测定,这种方法是基于磷钼酸和磷钨酸酚基团的氧化。5g细微的花粉样品用75mL70%(v/v)的甲醇振荡提取45min。用Buchner漏斗过滤后,残余物用70%的甲醇冲洗并且将最后的体积稀释到100mL,测定提取物。PVPP(PolyclarAT,CarloErba,Milano,意大利)溶解在pH3.5的10mL花粉的甲醇提取溶液中做空白对照。PVPP作为酚类化合物的吸收剂被加人。在760nm下读取吸光值,分别用5、25、50、100、150和200mg/kg的没食子酸做标准曲线以测定酚。在pH4下用含有1%NaCl的10%的凝胶溶液沉淀含水提取物(10mL),通过吸光值之差测定鞣酸。

2、黄酮类化合物

测定5g细微花粉样品的总黄酮。在样品中加入1mL0.5%的六甲基四胺(w/v)、20mL丙酮和2mL0.1N的HCl,回流30min,过滤,取滤液,用丙酮定容到100mL,残余物用20mL丙酮冲洗。将10mL的提取液与20mL水、25mL的乙酸乙酯置于分液漏斗中,用乙酸乙酯提取3次。提取物用水冲洗两次,每次用水50mL,随后用乙酸乙酪定容至100mL。根据德国药典中的方法进行总黄酮的测定,在10mL提取物中添加1mL2%的A1C13的甲醇溶液(在甲醇中添加5%的乙酸),在425nm下读取吸光值,以8、16、24和32mg/kg芦丁制作标准。

3、游离黄酮苷元

HPLC检测游离黄酮苷元。5g细微的花粉样品溶解于25mL的乙酸乙酯中,然后加入125mL40%(NH4)2SO4和250mL20%的HPO3,摇动烧瓶20min,提取物用Buchner漏斗过滤,溶液倒入分液漏斗中,收集上层相,重复提取步骤,有机相收集到100mL烧瓶中,在40℃以下真空干燥,样品重新溶解在4mL甲醇中,通过0.45μm的网眼尼龙过滤并定容至5mL。依据下列步骤进行HPLC操作:NucleosilC18柱(10μm)(4.6mm×250mm);DAD波长278~282和278。350nm;流动相a,双蒸水,pH2.6(H3PO4);流动相b,甲醇;流速2mL/min;甲醇浓度从0%到100%梯度洗脱33min;进样量20μL。色谱柱重平衡10min。通过外标法定量。

标准曲线是以峰面积对标准品的浓度(香草酸、丁香酸和异鼠李素5~20mdkg;对—香豆酸、邻—香豆酸、4-经基苯酸乙酯(对羟基苯甲酸乙酯)、反式肉桂酸、原儿茶酸、杨梅酮和看莰菲醇,5~100mg/kg;槲皮素25~250mg/kg;芦丁100~1000mg/kg)的线形回归建立,所有的标准曲线都通过原点,相关系数接近1(0.998~0.999)。含有标准品或提取物的溶液一直是避光保存以免降解。每周甲醇中成分的稳定性在375nm(黄酮醇)和340nm(黄酮)下进行分光光度检测。

4、酚类化合物的鉴定

采用HPLC鉴定不同的酚类化合物,按照Marham的方法经过羟基化作用、甲基化,与金属整和,利用波长从320~380nm和从240~280nm的增色效应及相应标识物的共同色谱分析。采用光谱对照技术比较光谱图,结合光谱图的匹配程度和峰纯度确定化合物。

控制好蜂花粉水分含量很重要,水分决定蜂花粉的微生物特性、感官品质和产品的货架期。除样品4外,游离氨基酸的最低量为2g/100g,显示该样品适宜的新鲜程度和正确干燥方法。蜂花粉的游离氨基酸含量的下降是因干燥或包装时温度过高,意味着营养下降。脯氨酸与氨基酸总量之比可当作花粉成熟度的指标。除5、7、11号样品之外,新鲜花粉和正确加工的蜂花粉均符合此指标(<75%)。

用分光光度法测定了多酚和黄酮成分的含量,多酚为1.24±0.20g/100g,黄酮为0.51±0.16g/100g。样品不能以鞣酸为指标检测多酚,64%的样品显示出多酚含量的最低值不低于1.20g/100g。在花粉的采集过程中,蜜蜂阻断α或β-葡(萄)糖苷酶引起糖苷部分酶水解成游离苷元。通过HPLC对游离黄酮苷元进行了定性定量的测定,其平均值为65.05±14.2mg/100g。不经化学水解,通过气相色谱可判定下述游离糖的存在:葡萄糖、果糖和蔗糖,低比例的二糖:海藻糖、异麦芽糖和麦芽糖,三糖中的棉子糖、erlose和松三糖。一旦蜂花粉被水解(1.2M的HCl,90℃,50%的甲醇水溶液(Y/v),反应时间为60min),可检测到其他的糖(如鼠李糖),与天然游离苷元(<95mg/100g)相比,黄酮化合物的比例相当高(>600mg/100g)。

蜂花粉的多酚和黄酮类成分

植物花粉含有大量的黄酮醇糖苷,它们存在花粉粒外壁上。酚类化合物的HPLC色谱图不能鉴别水解的和没有经化学水解的蜂花粉样品。我们不能鉴别蜂花粉的植物来源。按照表1和表2所得到的结果,游离类黄酮苷元能用来确定蜂花粉的质量。

多酚氧化酶是一种广泛存在植物中,能催化酚类化合物氧化和聚合成褐色素。乙酸乙酯和甲醇提取可以降低酶的活性。提取时间从30分钟延长到45分钟或样品量由3克增加到5克并没有影响提取效率和降解组分。与其他食品比较,蜂花粉中总多酚的含量偏高。

黄酮苷元与蜂花粉的质量相关,这些化合物的最小值可以作为产品可接受的指标。在最近的研究中,多酚、单宁、类黄酮、儿茶酚、表儿茶酸在鉴定可可粉、水果、蔬菜和加工食品的品质中是关键的指标。蜂花粉黄酮昔元的HPLC色谱图表明有15种组分,这15种化合物中能鉴别出13种。下面是被鉴定的化合物:①安息香酸衍生物(C6-C1)(3,4二羟基苯甲酸,原儿茶酸,4-羟基苯甲酸乙酯,香兰酸,丁香酸);②羟基肉桂酸(C6-C3)(对香豆酸,正香豆酸,反肉桂酸);③黄酮醇和黄酮(C6-C3-C6)(芦丁、槲皮素、茨非醇、杨梅酮、异鼠李素)。芦丁(槲皮素糖苷)是最重要的类黄酮糖苷的成分。11种化合物的组分相似,主要含有黄酮醇。方差分析表明11种蜂花粉的多酚、类黄酮化合物的含量有显著性差异(P≤0.05)。在鉴定的酚类化合物中,芦丁有最高的清除ROO-自由基的活性(以摩尔为单位)和人体红血球的光敏水解保护效果。更多养蜂技术和蜂产品知识请关注湖北天马养蜂场官方微信公众号:"honeymarket",或者加QQ号2969169050,欢迎投稿和交流讨论蜜蜂文化。

一般而言,黄酮醇和从叶、种子、水果发现的类黄酮是不错的抗氧化剂。除对肉桂酸以外,蜂花粉的酚酸类(经基肉桂酸和羟基苯甲酸)也都是很好的抗氧化剂。抗氧化活性随着临位二羟基基团的增加而增加。检测芦丁是检验蜂花粉质量的一种方法。芦丁含量较低表明蜂花粉贮藏期长或在干燥过程中加热过度。蜂花粉芦丁含量较高(29±7.98mg/100g),从18.35mg/100g到44.45mg/100g波动。蜂花粉的质量能从生物活性和营养价值方面给予充分的评价。因而,在欧洲市场上标准化西班牙市场销售的蜂花粉,芦丁最小含量为20mg/100g。蜂花粉的质量与保存期相关,营养价值和生物活性随着产品质量的不同而不同。

引自《中国养蜂》2005(10、11)

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