蜂蜜中酚类化合物的分析研究进展

发布时间:2011-09-10 16:17    文章来源:湖北天马养蜂场    浏览量:11612 次    【字体大小:正常 偏大 最大

蜂蜜用作食品的历史非常悠久,但直到最近几年才被证实具有抗氧化性。蜂蜜抗氧化性的强弱取决于蜜源、季节、环境因素,以及蜜蜂的酿蜜过程。据报道,蜂蜜中至少有181种物质与传统医药相关。蜂蜜中主要的抗氧化成分包括类黄酮和酚酸、酶类(葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶)、抗坏血酸、美拉德反应产物、类胡萝L素物质、有机酸、氨基酸和蛋白质等。这些天然的抗氧化剂,尤其是类黄酮类物质,具有抗菌、消炎、抗过敏、抗血栓形成和血管扩张等广泛的生物学活性。

蜂蜜的品质是由蜜源种类及其化学组成决定的,蜜源种类可通过分析蜂蜜中的花粉来识别。研究发现,用化学的方法有可能更加准确地识别蜂蜜的来源,这其中就包括了对类黄酮中有关酚类化合物的分析。例如:黄烷酮橘皮素已经用作柑橘属蜜的标记性成分,黄烷酮堪非醇用作蜜迷迭香蜜的标记成分,橡黄素用作向日葵蜜的标记成分。因此,对蜂蜜中酚类化合物的分析研究不仅有利于提高人们对蜂蜜抗氧化性的认识,而且对蜜源植物及其地理起源也有重要意义。

酚类是指苯及其稠环的经基衍生物。根据所含经基数目可分为一元、二元和多元酚。酚类化合物广泛分布于植物体中,至今已发现8000多个不同的结构。这些化合物具有防癌、消炎、防止动脉粥样硬化及血栓形成、免疫调节和止痛等作用。根据酚类化合物的基本结构至少可分成10类:简单的酚、酚酸、香豆素和异香豆素、萘酮、氧杂蒽酮、芪、蒽醌、类黄酮和木质素。其中,类黄酮是最重要的多酚类,拥有超过5000种已知结构的化合物。

一般来说,酚类化合物的分析程序包含三个基本步骤:提取、分离和定量。分析方法包括:比色反应、薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)和毛细管电泳法(CE)。

1样品制备

从样品中分离出酚类化合物是分析测试的先决条件。通常采用固相提取法,包括以下几个步骤:1份蜂蜜样品加5份水混合(用HCI调节pH为2),分离固体粒子;用离子交换树脂XAD-2过滤,酚类化合物仍然留在交换器内而糖和其他极性化合物被洗提,这使得类黄酮的收回率高于95%;交换器用酸(用HCl调pH为2)洗涤后再用蒸馏水洗。所有的酚用甲醇洗提;40℃减压条件下干燥。由于滤液中混有交换树脂,所以对提取物还要做一个修正,在装入前还需用磁力搅拌器搅拌10min。

用以下两种不同的方法进行下一步的提纯:①甲醇蒸发后获得了悬浮在蒸馏水中的残余物,用二乙醚萃取。醚的提取物是结合状态的,二乙醚可用氮冲洗,干的剩余物再用甲醇溶解过滤。②剩余物用甲醇溶解,溶液通过葡聚糖凝胶LH-20柱。酚在减压状态下浓缩干燥,然后再用甲醇溶解过滤。

2分光光度测定法

以Folin-Ciocalteu(弗林)试剂反应为基础的分光光度法是测定蜂蜜中总酚的一种广泛使用的方法,包括以纯的酚类化合物做标准,从样品中提取酚,颜色反应后测定其吸光度。比色测定的主要缺点在于它的特异性低,任何可氧化酚的羟基都会导致颜色反应的发生。

Folin-Ciocalteu法通常采用的步骤:蜂蜜样品经蒸馏水稀释并过滤,然后与Folin-Ciocalteu试剂混合5min,并添加碳酸钠。经温室培养后,在760nm处测定其吸光度,以甲醇作空白对照,用没食子酸做标准曲线,测定3次。酚类化合物的含量以每毫克没食子酸的量等价100g蜂蜜来表示。

3色谱测定法

高效液相色谱法(HPLC)无疑是最育用的分析多酚化合物的技术。气相色谱(GC)法开始时用于多酚化合物的鉴定。气质联用(GC-MS)法也用于蜂蜜中的类黄酮分析。

使用最广泛的HPIJC方式是反相HPLC。在这种情况下,固相由一个非极性的C18连接,流动相是一极性溶剂。

HPLC方法分离蜂蜜中的酚类化合物采用的分离柱有:XTerraRPl8(15cm×0.39cm,5μm),LichrocartRP-18(10,12.5,18.1cm×0.4cm,5μm),C18(15cm×0.46cm,5μm),DiscoveryRPAmideC16(15cm×0.46cm,5μm)。流动相有:A.水:蚁酸(99.5:0.5,95:5;19:1,v/v);B.甲醇。探测DAD的波长分别为:90nm,270nm,285nm,340nm。

提取系统:SPE(离子交换树脂XAD-2),二乙醚萃取,葡聚糖凝胶LH-20。用HPLC法分离鉴定出的化合物有:p-羟基酸、香草酸、丁香酸、P-羟苯基丙烯酸、肉桂酸、短叶松素、栎精、莰非醇、5,7-二羟基黄酮、高良姜精、鞣酸、杨梅酮、查耳酮、糖苷、毛地黄黄酮、8-甲氧堪非醇、5,4,二羟-7-甲氧基黄酮、柚木柯因、杨梅酮、茨非醇、二甲醚、8-甲醚、3-甲醚、8-甲氧基咖啡酸、顺反脱落酸、反反脱落酸、柯因、桔皮素、栎精糖苷、咖啡酸、苯乙烯酸、镓酸、绿原酸、p-香豆酸、O-香豆酸、阿魏酸、五羟黄酮、栎皮酮、苯甲酸、肉桂酸、3-甲基栎皮酮、尿黑酸等。

在色谱测试中,使用最多的波长是290nm和340nm。由于一些酚类化合物表现出多个吸收最高值,因而推荐使用同步复合紫外光(光电二极管排列)来识别,同时这种探测器还提供伴随有任何波长洗提带的吸收光谱层析图。用这种方法,吸收谱能与保存参数结合来鉴定未知的物质,同时还可测定洗提带的纯度。

NMR光谱测定法常被作为测定多酚结构的补充技术使用。

4电泳测定法

毛细管电泳(CE)法和HPLC法常被用作分析蜂蜜中酚类化合物的方法。毛细管电泳法具有分析次数少和分离效率高的优点。快速、简便、高分辨率和低操作成本使得这一技术在改进鉴定蜂蜜酚类化合物技术方面极具吸引力。

毛细管电泳法分析蜂蜜样品和酚类化合物的最优条件(毛细管的有效长度、毛细管的内部直径、检测的波长、电压、温度、注射时间、缓冲液浓度)见表1。

蜂蜜中酚类化合物的分析研究进展

5小结

蜂蜜的质量取决于它们的化学成分和植物来源,而多酚化合物的含量受到植物来源、地理来源和气候特征的影响,因而鉴定和量化蜂蜜中的多酚化合物意义重大。此外,蜂蜜中的多酚如类黄酮和酚酸等具有很强的抗氧化活性,这一特性对人类的健康有益。近年来,通过多种现代分析技术,如GC,HPlC,CE法,并结合二极管探测和光谱测定,对蜂蜜中多酚化合物的种类、含量、结构等进行了越来越深入的研究,为蜂蜜中多酚化合物的应用奠定了理论基础。更多养蜂技术和蜂产品知识请关注湖北天马养蜂场官方微信公众号:"honeymarket",或者加QQ号2969169050,欢迎投稿和交流讨论蜜蜂文化。

参考文献(略)

引自《蜜蜂杂志》2007(1)

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