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指纹图谱在中药行业的应用及其在蜂产品中应用的展望

湖北天马养蜂场2011-09-10 16:12:33蜂蜜3293

摘要:本文介绍了指纹图谱的概念、主要应用领域和发展方向,并对指纹图谱在蜂产品中应用的必要性和可行性进行了阐述,认为指纹图谱技术将成为新世纪蜂产品质控平台的主要构建手段,为我国蜂产品优质品牌的创建奠定坚实的基础。

关键词:蜂产品;中药;指纹图谱;应用

蜂产品是纯天然的营养保健品和美容剂,能预防和治疗多种疾病,对人类健康有着重要的保健作用,已成为当前人类生活中不可替代的营养和保健品。我国是世界第一养蜂大国,多种蜂产品产量据世界首位。然而,现行的质量控制体系已难以保障蜂产品的质量,应用指纹图谱等现代分析方法改进蜂产品质量控制体系,已是势在必行。

1指纹图谱的概念

指纹图谱是指某种天然物质经适当的处理后,采用一定的分析手段,得到的能够标志该物质特征的色谱或光谱的图谱,此图谱能较好地反映复杂成分的物质内在质量的均一性和稳定性。指纹图谱(fingerPrinting)是借用DNA指纹图谱发展而来。最先发展起来的是中药化学成分色谱指纹图谱,特别是高效液相色谱(HP比)指纹图谱。HPLC等现代化学分析仪器具有很高的分离度,可以把复杂的化学成分进行分离而形成一张具有被分析物质信息的色谱图,其中色谱峰的高度和峰面积值分别代表了该物质中不同化学成分及其相对含量。色谱指纹图谱不但具有所分析的天然物质特征的体现,而被应用于定性鉴别;同时还体现了量的概念,其色谱峰的高度或峰面积表征了某成分的相对含量。定性和定量的结合使得色谱指纹图谱具有强大的功能。

目前,指纹图谱已成为国内外公认的鉴别和评价天然药物质量的最有效手段之一,并被美国、德国、印度、日本等国家和欧共体组织广泛应用。

2指纹图谱主要应用领域和发展方向

21世纪以来,指纹图谱主要在我国中药行业中得到广泛应用。上世纪末,我国中药行业开始进行指纹图谱的研究,现已获得重大进展,被公认为研制开发“安全、有效、稳定、可控”现代中药的必要手段。

长期以来我国的中药制剂一直难以进入世界医药主流市场,难以参与国际竞争,其关键原因在于长期以来缺乏被国际认可和接受的严格的客观标准和规范。中药材及中成药质量的可控性是中药以药品名义进人国际市场的主要问题之一,同时人们也认识到中药不宜用单一有效成分代表其质量,故提出了色谱指纹图谱的评价方法。

目前,色谱指纹图谱技术已成为国内外公认的鉴别天然药物品种与质量的有效手段,国家药品监督管理局已于2000年底颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》,率先在中药注射剂领域推行指纹图谱作为质控标准。

2.1薄层色谱(TLC)技术

薄层色谱独特的优势是提供直观形象的可见光或荧光图像,即较柱色谱多了色彩这一“参数”,并可进一步数码处理数据,它的主要不足是“柱效”较低,对靠细微特征方可鉴别的指纹特征,灵敏度也嫌不够,对外部环境条件(温度、湿度)要求较高,操作要求规范、熟练。中国药典2000年版一部采用薄层色谱法作鉴别的品种已达602种,占一部中已收载中药材、中药成方制剂的60.7%,相比于1990年版20.5%有了大幅度的增加E2I。袁旭江、林励等采用二次展开薄层色谱法分离化梅红中野漆树昔与柚皮苷,结果化橘红中柚皮昔与野漆树昔在紫外光254nm下显示分开的暗斑点;经显色后柚皮昔斑点显紫红至橘红色,野漆树昔斑点显灰绿至灰红色;两者的Rf值在0.30~0.45之间,其分离度大于1.6。

2.2气相色谱(GC)技术

GC具有分离效能高、分离速度快等优点,所得的色谱轮廓,其重现性好、分辨率相对来说较好,由于是封闭系统色谱,外界影响的因素较少,稳定性较好,检测设备可选性较大,特别适用于挥发性药材和制剂的指纹图谱的研究与应用。具体应用中多与质谱联用,快捷而灵敏。冯毅凡等对华伦再造丸及其主要药味红花、川芎、当归、天南星、冰片、吴茱萸的石油醚提取物进行了气相色谱分析,获取了其GC指纹图谱,并根据其指纹特征对华伦再造九的质量进行了评价。叶祟义采用程序升温毛细管气相色谱法分析挥发油成分,建立了术类药材气相色谱保留指数(GC-IR)的指纹谱,并根据色谱峰的重叠率和含量特征分析对比,以此对术类药用植物近缘关系进行了探讨。

2.3高效液相色谱(HPLC)技术

与GC法相比较,HPLC法不受样品挥发度和热稳定性的限制,分辨率高,梯度洗脱加二极管陈列检测器可得到三维图谱,适用于成分比较复杂紫外光区有吸收的试验对象,ELSD检测器可以解决没有紫外吸收的物质的检测。HPLC的适用性与灵敏度得到显著提高,从而使复杂样品的分析成为可能。

颜玉贞等有效地鉴别西青果(河子属植物的幼果)及不同种的河子的区别,采用梯度洗脱,紫外检测建立了二者鞣质类成分的液相色谱指纹图谱。陈志霞、林励m等应用HPLC法研究不同品种和产地化橘红药材黄酮类成分,以柚皮苷为参比,以相对保留时间和峰面积百分比为参数,建立10个样品的HP比指纹图谱,标示出30多个峰,且不同品种化橘红图谱存在较大的差异,适用于化橘红药材的质量控制与鉴定。

2.4高效毛细管电泳(HPCE)技术

HPCE具有柱效高、分析速度快、毛细管清洗容易,仪器维修简单、可直接分析水溶液等特点,在中药分析中越来越显示其优越性。利云、王天松等分别对HPCE法在药物分析中的应用进行了评述和展望,并对其与HPLC法进行了比较,肯定了其在中药指纹图谱研究中的应用。孙沂等圆采用毛细管区带电泳法,建立了10批红花道地药材的指纹图谱,并与9个产地的红花药材以及红花的对照药材加以比较。结果显示不同产地红花药材的指纹图谱中,共有峰的相对峰面积有一定的差别,HPCE指纹图谱分析法可作为红花药材的质量控制方法。

2.5红外光谱(皿)技术

IR是以研究物质对红外辐射的吸收特性而建立起来的一种定性、定量分析方法。红外光谱具有高度的特征性,对单一化合物来说,没有两个化合物的红外光谱是完全一致的,即每一种化合物都有自己特征的红外吸收光谱。对中药而言,每一味中药都是由多种化学成分组成的,中药复方更是如此,其红外光谱是其所含各种化学成分红外光谱的综合叠加。

由于同一种中药其化学成分是相对稳定而又有别于其它中药的,因此其红外光谱必然具有较高的特征性、重现性和可比性。我们可以把中药材的某一有效部位的红外光谱的轮廓特征看成是该中药的指纹,用以鉴别中药。曾明等对不同产地的野葛及同属其它8种植物根的甲醇提取物进行红外光谱测定,结果表明,不同产地野葛的红外光谱特征几乎一致;而葛属的不同植物具有各自的特征,红外光谱可作为它们的鉴别方法。田进国等利用IR法对南、北五味子、不同产地白芍与赤芍、不同产地与不同品种当归、人参和西洋参、平贝母等5种贝母类药材、拘骨叶与十大功劳叶以及三十多种药材对照品等多种中药进行了鉴别研究。张文惠等对南北葶苈子进行了鉴别,还利用特征峰位比值法对差别性很小的羚羊角、绵羊角与山羊角进行了鉴别。张亮等将人工神经网络应用于中药材雷公藤和昆明山海棠的分类识别研究,用误差反向传播学习算法对中药材雷公藤和昆明山海棠浸出物的红外光谱进行了分类识别。随着化学计量学和计算机技术的快速发展,近红外光谱分析已进入分析弱信号和多组分分析的时代。

2.6其他技术

其他技术如x射线衍射技术、核磁共振(NMR)技术、紫外(UV)等技术均已应用于中药的化学指纹图谱的建立。此外,人工神经网络法(ANN)已在许多学科中具有广泛应用,这种方法具有分布存储、平行计算、容错和自适应能力,使其在测量数据的特征提取中占重要地位。目前,人们已对指纹图谱信息化包括数据的获取和数字化进行深入研究,在获得指纹图谱数据后,再应用人工神经网络法等信息处理方法对数字特征进行处理。由此可见,在信息化时代,指纹图谱将得到突飞猛进的发展。

3指纹图谱技术在蜂产品中应用的必要性和可行性

3.1指纹图谱技术在螃产品中应用的必要性

蜂产品是纯天然的营养保健品和美容剂,能预防和治疗多种疾病,对人类健康起着重要的保健作用。现代药理研究表明,花粉、王浆等蜂产品有具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、降血糖、延缓衰老等多种功效。临床发现蜂产品能够治疗肝炎、糖尿病、习惯性腹泻等多种疾病对肝脏无毒害和副作用,花粉壁具有稳定作用,含有类似胡萝L素和维生素E,这种化合物是良好的防衰老剂,能稳定细胞膜。目前蜂产品己越来越广泛地应用于医药、食品、化妆品等领域,已越来越引起人们的关注和重视。但是由于种种原因,使得蜂胶的安全性和功效不稳定,导致蜂产品的质量难于保障。蜂产品的化学成分复杂,仅以蜂胶所含的黄酮类成分为例,己发现的黄酮类化合物已达到71种之多,包括白杨素、良姜素、高良姜素、芦丁、杨梅酮、桑色素、椒皮索、山奈素、芹菜素、柯因和松鼠素等;此外,蜂胶尚含丰富的花烯类和酚类等成分。

由于蜂产品中成分种类和数量众多,而现有的蜂产品质控标准仅有有效部位或有效成分的含量测定等指标,显然尚难以科学、全面地判别蜂产品的真伪优劣,也难以科学有效地评价其质量,因此,社会上以次充好、以假当真的案例屡见不鲜。

蜂产品的质量控制一直是一个突出的问题,蜂群的活动范围广,原料来源差异性很大,容易通过生物富集作用而累积有害物质,有效成分含量波动性很大,质量控制非常困难,因此,国产蜂产品要走向世界,必须解决此“瓶颈”问题;使评价原料及其制剂质量的标准做到与国际接轨,得到国际认可和接受。

由于指纹图谱给出的有关质量的信息量远比任何单一成分测定所得的信息量要多,所以它能够有效的鉴别蜂产品的真伪和质量的优劣,在蜂产品的研究开发中,指纹图谱可以在很大程度上反映蜂产品研制所用的原料、工艺贮存过程中化学成分的变化情况,更有效地进行蜂产品研究的全程跟踪,使研制的蜂产品质量更趋稳定和一致。在蜂产品研制的过程中结合药效和临床观察,可以建立药效与化学成分的关联,通过指纹图谱的研究,阐明蜂产品的“谱”“效”关系,将有利于蜂产品的品牌创新和出口创汇。

3.2指纹图谱技术在蜂产品中应用的可行性

近年来,指纹图谱已在蜂产品质量控制中得到初步应用,主要体现在蜂胶指纹图谱研究方面。朱思圆等采用RP-HPLC研究了不同产地蜂胶HPLC指纹图谱,结果表明:不同来源的蜂胶所含黄酮类成分之间的相似性较大,其差异较小。周萍等人从蜂胶的功效成分—黄酮类化合物着手,测定了真品蜂胶、杨树胶和搀假蜂胶的HPLC指纹图谱。结果发现:真品蜂胶含有19个特征峰中的18个特征峰,缺6号峰;杨树胶含有19个特征峰中的17个特征峰,缺7号和11号峰;搀了杨树胶的搀假蜂胶,含有6号峰,而7号峰和11号峰的峰面积显著降低;通过HPLC指纹图谱可以对蜂胶的真伪进行初步鉴别。马海乐等人也进行了将指纹图谱应用于蜂胶的尝试。

中药指纹图谱已蓬勃发展多年,并取得令人瞩目的成绩。而蜂产品中,已有蜂胶、蜂蜜、蜂巢等作为中药列入中国药典;因此,在蜂产品中推行指纹图谱技术具有理论基础。同时,前期研究结果也表明,在蜂产品中应用指纹图谱技术是完全可行的。

我国是世界第一养蜂大国,拥有700多万群蜜蜂,多种蜂产品产量据世界首位。但由于国内蜂产品质量难以保障,已显著影响了我国蜂产品的出口创汇能力。为了更好的控制蜂产品的质量,应当应用薄层色谱、液相色谱、质谱技术、光谱技术等现代指纹图谱技术,根据蜂产品的指纹特征及作用效果的对应关系,构建能够真正反映蜂产品质量真伪优劣的指纹图谱,科学地构建蜂产品质控平台,确保蜂产品质量稳定可控、使用安全有效。如此,将能极大提高我国蜂产品原料及蜂产品的质量,提升我国蜂产品的品牌和国际声誉,显著增加我国蜂产品出口创汇能力。可以预料,指纹图谱技术将成为新世纪蜂产品质控平台的主要构建手段,为我国蜂产品优质品牌的创建奠定坚实的基础。湖北天马养蜂场,加我们的微信一起学养蜂。

参考文献(略)

引自《中国蜂业》2007(7)