摘要：蜜蜂体内的抗菌肽主要是受到微生物或其他外源物质的侵染时产生的apidaecin、abaecin、beedefensin和hymenoptaecin等，本文对它们的分子组成、结构、抗菌特性、基因的表达、分布及抗菌机理等问题进行了概述。同时还对王浆腺产物中的royalisin和其他抗菌小肽，以及毒腺中的主要毒蛋白melittin等的抗菌作用进行了分子结构、抗菌机理和编码基因等方面进行了论述。
关键词：蜜蜂；抗菌肽；蜂毒肽；royalisin
昆虫在受到微生物或其他外源物质的浸染时，血淋巴会产生相当数量的抗菌蛋白或抗菌肽，这些肽类物质主要是由脂肪体合成后分泌到血淋巴中，是一种十分有效的防御机制，可用来迅速杀死或清除外源的微生物。不同于动物的免疫应答，昆虫没有严格意义上的免疫应答机制，昆虫血淋巴所产生的这些抗菌肽可以由一种微生物入侵产生，没有特异性，诱导产物不是只对特定的入侵微生物产生的，通常对其他微生物也有抗生作用[1]。一般具有对热稳定，抗酸碱和活性离子浓度范围广等特点。尽管如此，血淋巴内的不同的抗菌肽在具体的抗菌作用方面还是表现出一定的差异，有些对革兰氏阴性菌起作用，有些对革兰氏阳性菌起作用，有些则是对真菌有较强的杀伤作用。血淋巴内的这些不同的抗菌肽相互补偿，共同抵抗外源微生物的侵染；抗菌肽按其化学构成、抗菌范围以及抗菌机制的不同主要可分为五大类：1溶菌酶型；2短链（20－40氨基酸残基）α螺旋型，与膜的离子通透性有关；3分子内二硫键型，抗菌过程涉及到膜的破坏；4富含精氨酸/脯氨酸型（Arg-Pro-Rich）和长的多功能域型（Longmulti-domain），一般序列较长（大于70个氨基酸残基），苷氨酸的含量较高，有特定的功能域，与其他的四类抗菌蛋白没有序列或模体（Motif）上的相似性[1-2]。
蜜蜂在受到大肠杆菌感染后，血淋巴内会产生几种抗菌肽，主要有apidaecin、abaecin、beedefensin和hymenoptaecin[3]，这几种肽类物质具有不同的分子量，化学组成和结构就有不同的特点，相应的在抗菌的机制和作用上也有所不同。近年来，由于部分抗菌肽对与人类健康相关的一些微生物具有很强的生物活性，具有很大的应用潜力。因此，在这方面也进行了许多工作，本文拟介绍这方面的研究情况；另外，蜜蜂毒液中也含有的一些毒蛋白，如melittin等也具有明显的抑菌作用，蜂王浆中近些年来也报道有两种具有抗菌作用的多肽（royalisin和另一种小肽），在此也一并作一介绍。
1蜜蜂血淋巴中的抗菌肽
1.1apidaecin
apidaecin是一种含有18个氨基酸残基的小肽，富含脯氨酸，感染微生物的蜜蜂体内的apidaecin是由许多异构物组成，主要对革兰氏阴性菌起作用，最低抑菌浓度在10-8－10-6M之间[3]。
膜翅目昆虫的apidaecin类型的肽类物质在序列上大致可分为保守区（与一般的抗菌作用有关）和可变区（与特异性的抗菌作用有关），可变区氨基酸残基的改变有可能导致所抗菌株的改变，而保守区序列的改变则常导致抗菌作用的减弱和丧失[4]。
编码apidaecin的基因转录成的前体mRNA是由Prepro－Sequence（编码16个氨基酸的信号肽序列）、Pro－Sequence（编码16个氨基酸的前序列）、数量不等地由几乎相同的84个核甘酸组成的重复单元（一般为1－12个）以及此C－末端序列而成，每个单元由一个编码成熟的apidaecin的序列和编码6－8个氨基酸以及一个二肽序列RR（N－末端的第一个单元的二肽是两个精氨酸AA）组成。
apidaecin的成熟过程主要有以下几个步骤，首先，翻译的蛋白在相关酶类的作用下去除信号肽，余下的包含成熟的apidaecin串连单元在内切蛋白酶（endoproteae）的作用下，在二肽的C－末端切开，切开的二肽在carboxypeptidase“Kex2”的作用下进一步降解。余下的间隔序列和成熟肽部分由氨基二肽酶（dipeptidylaminopeptidase）每次从N－末端移去两个氨基酸，直至最终形成成熟的apidaecin。
不同于其他的抗菌肽形成孔道破坏膜的通透性，apidaecin不形成孔道，主要是涉及一种定向的选择机制进行的。通过研究apidaecin的不同变异形式及构型对革兰氏阴性菌的抑菌作用，人们发现apidaecin的作用是有手性的，也即有方向性的，只有L－构型的apidaecin具有抑菌作用，而D－构型的尽管能进入细胞内，但并不表现出抑菌作用；不同的变异类型对抑菌作用的影响大小不同，在所谓的保守区的很小变化，就会导致抗菌性能的完全丧失，而在可变区的变异则导致对原来菌株作用的丧失，但又会对一个新的菌株有作用，即决定不同菌株的抗性；抑菌作用的大小与进入细胞的apidaecin分子的多少有关，L－脯氨酸对于apidaecin进入细胞有竞争作用。apidaecin分子进入细胞是一个消耗能量的过程，并且是不可逆转的。通过膜的机制可能涉及膜上的转运蛋白，但转运蛋白并不是apidaecin作用的终点，很可能进入细胞内后再与靶标分子作用，影响细胞内的一些重要代谢过程，从现有的资料来看，这一过程很可能涉及蛋白合成过程[5]。为进一步利用apidaecin，在apidaecin的分泌型表达[6]和不同的变异型的抗菌性能检测[7]方面做了有益的探索。
apidaecin的这种多组分存在的现象，一般只有两种解释，一是存在多等位基因，一是来自于一个多基因家族。而apidaecin在序列上是高度一致的，但其转录产物的长度是多变的，所包含的重复单位数量不等，差异很大，这点很难由等位基因理论来解释。为了解apidaecin基因的组织方式，以5’－和3’－非编码区序列作引物，以基因组DNA为模板，进行PCR反应，获得的不同长度的产物都能够同apidaecin的编码序列杂交，说明存在不同的apidaecin基因。为阐明这些基因在染色体上是分散的还是聚集在一体的，提取基因组DNA，用HindIII酶切，然后作Southern杂交，证实这些基因位于一个15kb的酶切片断上，该片断进一步用EcorI酶切成两个5.1和6.4Kb的片断，分别用5’－和3’－非编码区序列作探针进行Southern杂交，也都有信号产生。这一组试验说明，编码apidaecin的基因是以族聚的形式分布于染色体上的[8]。基因的这种分布形式，至少有两方面的益处，一是可以有冗余的基因进行变异，以利于物种的存活繁衍；另一方面就是基因产物在量上的效应，可以在短时间内表达大量的产物，行使相应的生物功能。
1.2beedefensin
beedefensin则是在免疫诱导的蜜蜂血淋巴内分离发现的，该成分在免疫诱导的蜜蜂血淋巴内含量极少，比其他三种诱导肽类少20－50倍。在序列组成上与royalisin几乎相同，也是由51个氨基酸残基组成，仅在第50位的氨基酸残基不同，有beedefensin中的精氨酸代替royalisin中的酪氨酸。同样对革兰氏阳性菌有作用；通过编码Beedefensin的cDNA克隆的分析，在C－末端应该还有一个甘氨酸，而在成熟肽中则没有这一残基，据此，人们认为beedefensin的C－末端是酰胺化的，C—末端的甘氨酸提供－NH2，这种酰胺化的修饰作用对于稳定分子的双螺旋结构进而保障分子的溶菌活性是非常重要的[9]。beedefensin前体结构是由19个氨基酸组成的信号肽序列、22个氨基酸组成的前序列以及51个氨基酸组成的成熟序列组成。
1.3hymenoptaecin
hymenoptaecin是由93个氨基酸残基组成的阳离子型多肽，与所有已知的抗菌肽不同，其N－末端有一个2－吡咯酮－5－羧酸，在生理条件下，能够抑制革兰氏阴性菌和少数革兰氏阴性菌的生长，最低抑菌浓度较其他抗菌肽要低。同时，不同于其他抑菌肽在离子浓度增加时抑菌效果降低的特性，hymenoptaecin的抑菌效果并不随溶液中离子强度的增加而减少。其前体结构则是由17个氨基酸组成的信号肽序列、17个氨基酸组成的前序列以及93个氨基酸组成的成熟肽组成。
hymenoptaecin的抑菌作用主要涉及对细菌膜通透性的影响。利用大肠杆菌细胞内的β－半乳糖苷酶基因，在培养液中加入一定浓度的诱导剂IPTG，表达该基因，然后在培养液内加入生色底物ONPG，连续跟踪测试溶液的吸光值，可以反应出该底物进入细胞的速度，可以从一个方面反映细胞膜的通透性。利用此原理，可以测得hymenoptaecin对细胞膜的通透性有破坏作用[2]。Tween20可以加速这一进程，Tween20和其他的一些去垢剂能够融解细胞内膜的一些组成蛋白，通过融解作用破坏内膜，进而对细胞造成破坏。而单独的Tween20不能通过细胞外膜，在hymenoptaecin的作用下，Tween20可以进入细胞外膜，连同hymenoptaecin一起，直接对内膜起作用，从而加速对细胞内膜的破坏，膜的通透性和膜电势的正常状态是细胞正常功能得以维系的重要条件，许多重要的生化反应都在细胞膜上进行，如呼吸作用的进行和ATP的合成等，由于hymenoptaecin对于厌氧菌和好氧菌的作用是一样的，因此对于氧化磷酸化的影响至少不是第一位的。由此，有观点认为是膜的正常的动态运输功能被破坏了，但具体是否是这一点拟还是涉及其他的重要功能还需进一步的试验证实。但有一点可以确定，hymenoptaecin影响了细胞的一些十分重要功能，从而表现出较强的抑菌作用。
1.4abaecin
abaecin含有34个氨基酸残基，其中包括10个脯氨酸残基，氨基末端序列与apidaecin相似，但比apidaecin有更广谱的抗革兰氏阴性菌的作用，对植物来源的革兰氏阴性菌的抑菌活性更低[10]。abaecin的前体由19个氨基酸组成的信号肽和34个氨基酸组成的成熟肽组成，没有Pro－sequence序列，因此它的加工成熟过程非常简单，只需将信号肽除去即可。意味着它在分泌完成后就是一个成熟的分子了。
不同于apidaecin的多基因族聚分布形式，beedenfensin、abaecin和hymenopaecin三者经Northern杂交分析表明均只有一个转录本。
蜜蜂体内的这几种经诱导产生的抗菌肽，defensin的转录水平较低，在膜翅目之外的其他种昆虫体内也有报道。另外的三者抗菌肽只在膜翅目昆虫体内存在，转录的水平较高；其中，apidaecin的转录比较容易被激活，轻度的感染就可诱发该基因的转录和表达，通常基因表达量也很高，感染后很快就会表达，对许多革兰氏阴性菌起作用。这可能与蜜蜂在自然条件下的所接触感染的是植物来源的革兰氏阴性菌相关，这些病原菌对apidaecin也十分敏感；作为这一机制的补充，hymenopaecin主要是对apidaecin产生抗性的部分革兰氏阴性菌起作用；apaecin的抗菌作用比较弱，似乎是作为一种备份机制，主要对apidaecin产生抗性的菌株起作用。hymenopaecin和apaecin的转录和翻译需较强的诱导刺激，表达的量较少，在时相上也比较迟；相比之下，beedefensin的表达量最少，是蜜蜂血淋巴内唯一的只对抗革兰氏阳性菌有作用的肽类。因此，蜜蜂体内的这几种抗菌肽的抑菌作用不是相互重叠的，而是互补的，共同抵御各种微生物的入侵。
上面几种抗菌肽主要是以西方蜜蜂为材料所得到的结果。胡义镰等[11]利用中华蜜蜂研究作材料，用大肠杆菌免疫，研究发现了两种具有抑菌作用的抗菌肽。一种分子量为11kD，另一种小于5kD，两者均有较强的耐高温，耐酸碱。
2王浆中的抗菌肽
royalisin是在蜂王浆中发现的一种抗菌肽，是由51个氨基酸残基组成，分子内有三个二硫键，分子量为5523Da，是一种双亲型的蛋白，C－末端序列富含带电的氨基酸残基。相应的抑菌试验证实该蛋白对革兰氏阳性菌有很强的抑菌作用，在低至1μM的浓度下有效地起作用[12]。另外，royalisin也有抗真菌的作用[13]。
除royalisin之外，在蜂王浆中利用分子筛柱层析的方法分离得到了一种富含甘氨酸（甘氨酸占33％）的小肽，含有8种氨基酸，分子量为2.3kD，抑菌试验证实对革兰氏阳性菌有作用[14]。
蜂王浆中的这些抗菌肽和王浆中的10－羟基－葵烯酸的抗菌作用对于正常生存和发育具有重要的意义，蜂王浆是由蜜蜂的王浆腺和上颚腺分泌的，并经专门的分泌管与口道相连，这些抗菌肽与哺乳动物消化道内发现的抗菌肽[15]的作用是相似的，防止直接与外界接触的组织器官感染；另外，我们知道，新孵化的蜜蜂幼虫，无论是工蜂、蜂王还是雄蜂，早期阶段都是以王浆为食的，这些抗菌物质的存在，对于它们的存活是非常有意义的。另外，有报道说明蜂王浆中存在有一个55kD的蛋白，对于细胞的增殖和发育有促进作用[16]，royalisin的分子量与该蛋白相近，是否属于相同或相近的物质以及是否还有其他方面的功能，还需进一步的研究。
3蜂毒中的抗菌肽
蜂毒肽（melittin）是蜂毒中的主要成分，约占蜂毒干重的50%，具有抗菌、消炎、抗关节炎等作用，仅几年的研究发现蜂毒肽在抗肿瘤，抗辐射方面也有独特的作用。蜂毒肽前体的结构由三部分组成，N－末端的21个氨基酸组成的信号肽，接着22个氨基酸的pro-sequence序列，再后面是26个氨基酸的成熟肽。目前关于蜂毒中抗菌肽的报道基本都是关于蜂毒肽的，由于蜂毒肽具有极强的溶血作用，在对其抗菌性能的利用上就有很大的限制。因此，如何提高蜂毒肽的抗菌作用而抑制溶血作用就变得非常重要。
蜂毒肽的抗菌作用主要是C－末端的序列的作用，合成的C－末端15个残基多肽溶血性能降低了300倍，而抗菌作用只降低5－7倍。进一步研究发现，若将C－末端的两个带正电荷残基移向N－末端，则抗菌活性与蜂毒肽相差无几，而溶血活性与前者相仿[17]。为研究抗菌肽结构与功能的关系以及提高蜂毒肽的抗菌作用，人们将其他抗菌肽的部分序列与蜂毒肽的C－末端序列构建杂和序列，也表现出抗菌活性[18-20]。人工合成的缺失α－螺旋的蜂毒肽的非对眏异构体，其溶血作用消失但抗菌作用完全保持[21]。手性对于抗菌作用并不是必须的，D－构型的蜂毒肽和L－构型的蜂毒肽的抗菌作用没有差别[22-23]。环形的蜂毒肽比线形的蜂毒肽有更强的抑菌活性和更低的溶血活性[24]。
以上是有关蜜蜂抗菌肽的研究概况，许多问题目前我们还没有办法全部明了，但随着研究的进一步深入，它们的分子特征、作用机制等问题清楚之后，我们可以利用现代生物学的技术和手段，体外人工大量生产蜜蜂抗菌活性肽，并以成熟的产品造福于人类。
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