蜜蜂活体电穿孔法导入DNA的新技术

发布时间:2011-08-07 12:17    文章来源:湖北天马养蜂场    浏览量:2575 次    【字体大小:正常 偏大 最大

蜜蜂是一种重要的经济昆虫。同时,蜜蜂也是研究真社会昆虫个体特征分化最典型的模式体系,蜜蜂已成为系统论、行为生态学、神经学和老年化研究的模型。蜜蜂具有世代周期短、繁殖率高、后代个体数多、能大量饲养、易获得大量性状一致、发育同步的群体等优点,是理想的实验动物研究模型。

蜜蜂作为人类开发利用最早和最成功的少数昆虫之一,现在人类对于蜜蜂的遗传学、生理生化等的研究非常充分。蜜蜂种质资源十分丰富,蜜蜂基因组测序计划已完成,蜜蜂转基因研究具备非常有利的条件。如果人类能研究发展出一种较为完善的转基因蜜蜂技术体系,不仅为我们进一步认识蜜蜂提供帮助,而且可在此基础上建立起蜜蜂实验模型,将对蜜蜂的分子生物学研究起重大推动作用;还可以利用转基因技术改良蜜蜂品种以提高蜂产品生产效益、增强农作物授粉,或者研制蜜蜂生物反应器,生产生物活性物质。通过制造转基因蜜蜂能够检测内在基因功能,有助于充分理解蜜蜂认知、记忆等功能的分子基础,对于理解基因与行为之间的关系非常重要。因此转基因蜜蜂的研究具有重大的理论意义与经济效益。

转基因蜜蜂的研究是指用实验导入的方法将外源基因在蜜蜂染色体基因内稳定整合并能稳定表达,其实质是定向改造蜜蜂的遗传组成。蜜蜂作为一种真核生物,其基因组结构和功能的复杂性给基因工程带来了极大的困难,尚需通过大量研究找到一种对蜜蜂转基因的有效模式,从而使外源基因能有效地转入、整合并获得高效表达的新品种。国内外科研人员在转基因蜜蜂的研究上进行了许多尝试,并开发出多种蜜蜂DNA导入方法。如精子载体法、脂质体法、显微注射法、电穿孔法等,其中,电穿孔是一种方便、迅速、高效率的基因转移技术,本文对电穿孔法进行蜜蜂外源DNA转移作一下综述性介绍。

1电穿孔法原理与特点

蜜蜂活体电穿孔法导入DNA的新技术

电穿孔的原理就是利用高压脉动作用将外源基因导入精子、受精卵、胚胎或胚胎干细胞内,在极短暂的时间让细胞暴露在高电场下,使得细胞的细胞膜产生相当微小的孔洞,结果病毒颗粒、DNA等正常情况下不能通过细脑膜的物质使得以进出细胞,使外源DNA融合至宿主染色体中,因而产生转基因动物。

电穿孔基因转染法相对其他转基因方法,有几个特点:首先在外源基因电穿孔导入靶器官的选择方面,理论上动物任何组织和器官都可作为电穿的研究对象。其次,电穿孔法对导入外源基因片段的大小没有限制,从几比或十几kb的表达载体,到100~200kb的YAC、BAC基因组,都有成功导入并获得表达的报道间。此外活体电穿孔法操作简易,基因转染过程在几秒钟内就完成,而且DNA片段不需要特殊的纯化操作,转移效率通常比较高;对于不同细胞组织器官、不同表达基因载体,外源基因表达的时间存在巨大差异。

2蜜蜂活体电穿孔法导入DNA的试验研究

近年来,活体电穿孔法用于动物转基因研究报道不断增多,成为基因治疗、生物学分析等领域非常受欢迎的一种技术。不过,电穿孔研究报道的昆虫种类不是很多:果蝇胚胎、谷实夜蛾胚胎以及家蚕等。家蚕电穿孔研究报告稍多,Moto等利用电穿孔方法成功地将家蚕丝素启动子驱动的GFP质粒导入家蚕幼虫脑细胞,经荧光显微镜检测,GFP得到组织特异性表达。赵昀等在将带有GFP基因的质粒导入家蚕卵时也尝试采用电穿孔法,蚕卵孵化结茧后,经检测约5400个茧中有73个带有荧光“亮茧”。Thomas利用电穿孔法将gfp基因导入了家蚕的早期胚胎、晚期胚胎、卵巢以及成虫阶段。2003年,李华等用电转移仪将胰岛素基因组基因导人家蝇,结果人胰岛素基因能够在蝇蛆中表达。

日本的TakekazuKunieda和TakeoKuboo报道了利用活体电穿孔法将外源DNA导入成年工蜂头部的研究。他们通过电击法将绿色荧光蛋白质粒DNA转移到成年蜂头部后,在头部原来插阳极的位置观察到绿色荧光,经RT-PCR和免疫杂交分析证实转导的外源基因获得表达。2004~2007年,郭冬生等对意大利蜜蜂和中华蜜蜂早、晚期卵电穿孔导入绿色荧光蛋白质粒DNA的技术、检测方法以及导人参数进行了系统研究,并用所得到的优化电穿孔参数对绿色荧光蛋白载体用于中华蜜蜂和意大利蜜蜂转基因的研究进行了测试;实验中获得了两组较佳电穿孔电击参数:中华蜜蜂卵(750v/cm,100μs,1)、意大利蜂卵门50v/cm,160μs,1);实验中选用优化的两组较佳电学参数电击,以电穿子L仪将绿色荧光蛋白质粒DNA导人蜜蜂早、晚期卵,观察到在处理卵孵化的幼虫申存在绿色荧光蛋白的表达;中华蜜蜂和意大利蜜蜂早期卵阳性表达率分别可达到0.29%~1.50%和0.31%~0.90%,晚期卵阳性表达不理想,分别只有:0.00%~0.47%(中蜂)和0.00%~0.30%(意蜂);同时蜜蜂早、晚期卵的存活率和导入的绿色荧光蛋白基因阳性比率是随蜂种、电压及脉冲时间的不同而变化;实验说明了活体电穿孔导入法可以用于蜜蜂早期卵的基因转染和表达。更多养蜂技术和蜂产品知识请关注湖北天马养蜂场官方微信公众号:"honeymarket",或者加QQ号2969169050,欢迎投稿和交流讨论蜜蜂文化。

参考文献(略)

引自《中国蜂业》2008(5)

宜春学院生命科学与环境资源学院

郭冬生宜春市林业局黄志样

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